TEKNIK PEWARNAAN MIKROORGANISME

BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008).
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Berdasarkan hal tersebut di atas, maka dilakukanlah praktikum ini untuk mengetahui teknik pewarnaan mikroorganisme baik itu dengan cara pengecatan sederhana, pengecatan negatif maupun pengecatan gram serta mengetahui morfologi mikroorganisme.
I.2 Tujuan Percobaan
Adapun tujuan dari percobaan ini adalah :
1. Untuk mengetahui teknik pewarnaan mikroorganisme dengan cara pengecatan negatif, pengecatan sederhana dan pengecatan gram.
2. Untuk mengetahui morfologi mikroorganisme
I.3 Waktu dan Tempat Percobaan
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Rabu, 25 Maret 2009, pukul 14.00- 17.30 WITA dan bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar.











BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008).
Macam-macam pewarnaan (Yulneriwanti, 2008) :
1. Pewarnaan negatif
- Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang
- Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta
2. Pewarnaan sedehana
- Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin)
- Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel
3. Pewarnaan diferensial
- menggunakan lebih dari satu macam zat warna
- Tujuan untuk membedakan antar bakteri
- Contoh: Pw. Gram, Pw. Bakteri Tahan Asam
4. Pewarnaan khusus
- Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri→ kapsul, spora, flagel dll
Cara pewarnaan negatif
- Sediaan hapus → teteskan emersi → lihat dimikroskop
Untuk mempelajari morfologi, struktur, sifat-sifat bakteri dalam membantu mengidentifikasinya, kuman perlu diwarnai.
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae (filzahazny, 2008).
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (filzahazny, 2008).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif dapat dilihat pada table berikut ini (filzahazny, 2008) :
Bakteri Gram Positif Bakteri Gram Negatif
Dinding Sel:
Lapisan petidoglikan Lebih tebal Lebih tipis

Kadar lipid 1-4% 11-22%

Resistensi terhadap alkali (1% KOH)
Lebih pekat Larut
Kepekaan terhadap Yodium Lebih peka Kurang peka
Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Resistensi terhadap tellurit Lebih tahan Lebih peka

Sifat tahan asam Ada yang tahan asam Tidak ada yang tahan asam

Kepekaan terhadap penisilin Lebih peka Kurang peka

Kepekaan terhadap streptomisin Tidak peka Peka


Teknik pewarnaan
Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dsb) dari bahan-bahan lainnya yang ada pasa olesan yang diwarnai (Hadiotomo, 1990).
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Hadiotomo, 1990).
Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang khas dibentuk oleh spesies ini disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifat-sifat ini menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar untuk dihilangkan. Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang Membentuknya (Dwidjoseputro, 1989).
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu (Hadiotomo, 1990) :
- Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
- Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit  10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.
- Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
- Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
- Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
- Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu (Hadiotomo, 1990) :
- Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
- Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
- Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
- Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
- Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
- Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu (Volk & Wesley, 1998):
1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
BAB III
METODOLOGI
III. 1 Alat
Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah mikroskop, objek gelas, ose bulat, gegep kayu,lampu spritus , korek api,pipet tetes,wadah baskom, botol semprot , dan hand sprayer
III.2 Bahan
Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah Aquadest steri, lBiakan Eschericia coli, Biakan Bacillus cereus, Biakan Salmonella typii, Gram A (Kristal violet), Gram B (larutan lugol), Gram C (Alkohol asam), Gram D (Safranin), Minyak imersi, Tissue roll, Alcohol 70 %, Spirtus, Larutan nigrosin (tinta cina).
III.3 Prosedur Kerja
A. Pengecatan Sederhana
1. Membuat preparat olesan bakteri Bacillus cereus dan Salmonella typii lalu fiksasi dengan pembakar spirtus.
2. Meneteskan larutan Kristal violet diatas olesan preparat tersebut sebanyak 1-2 tetes dan membiarakan selama 1-2 menit.
3. Mencuci dengan air mengalir sampai sisa cat tercuci habis, kemudian mengeringkan dengan hati-hati mengunakan tissue roll.
4. Mengamati dibawah mikroskop dengan menggunakan pembesaran 100x dan minyak imersi.
5. Menggambar dan mencatat hasil yang diamati.
B. Pengecatan Negatif
1. Membersihkan gelas objek dengan alcohol 70 % agar bebas lemak.
2. Mengambil 1 ose yang digunakan umntuk mengambil biakan, meletakkan biakan pada objek gelas kemudian mencampur dengan 1-2 tetes nigrosin.
3. Dengan menggunakan objek gelas lain menyentuhkan sisi objek gelas tersebut pada sampel tersebut sehingga membentuk sudut 300C, selanjutnya menarik objek gelas tersebut dengan arah yang berlawanan hingga membentuk film tipis.
4. Membiarkan hingga mengering lalu mengamati diubawah mikroskop dengan pembesaran 100x dan menggunakan minyak imersi.
5. Menggambar dan mencatat hasil pengamatan.
C. Pengecatan Gram
1. Menyiapkan preparat olesan bakteri Bacillus cereus, Eshcericia coli dan Salmonella typii lalu fiksasi pada pembakar spirtus.
2. Meneteskan larutan gram A sebanyak 2-3 tetes pada olesan bakteri, membiarkan selama 1 menit.
3. Mencuci dengan air mengalir dan mengeringkan dengan tissue roll dengan hati-hati.
4. Meneteskan larutan gram B, membiarkan selama 1 menit.
5. Mencuvi dengan air dan keringkan.
6. Meneteskan larutan gram C, membiarkan selama 30 detik.
7. Mencuci dengan air dan keringkan.
8. Menetesi dengan larutan gram D, membiarkan selama 30 detik, mencuci dengan air dan mengeringkan dengan tissue.
9. Mengamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100x dan menggunakan minyak imersi

Pembahasan
A. Pengecatan Sederhana
Pengecatan sederhana digunakan untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras antara sel dan latar belakangnya sehingga dapat mempertajam bentuk dari sel-sel mikroba itu sendiri, dengan cara mewarnai sel-sel mikroba dengan zat warna khususnya warna Kristal violet. Pada pengecatan sederhana digunakan bakteri Bacillus cereus dan Salmonella typii. Setelah pengecatan diperoleh bakteri tersebut berwarna ungu, yang berarti bakteri tersebut menyerap zat warna cat tersebut sehingga Nampak pada mikroskop. Zat warna yang umunya digunakan yakni yang bersifat alkalin (kromatofornya bermuatan +).
B. Pengecatan Negatif
Pada pengecatan ini digunakan cat asam nirosin (tinta cina). Pengecatan ini dilakukan untuk mewarnai latar belakang preparat sedangkan bakteri sendiri tidak terwarnai serta untuk mengamati ukuran, bentuk, dan tata letak sel. Setelah pengamatan dibawah mikroskop diperoleh preparat mikroba berwarna hitam sedangkan bakteri sendiri tidak berwarna (berwarna putih) dan berbentuk basil (batang).
C. Pengecatan Gram
Pengecatan gram termasuk pengecatan diferensial yang digunakan untuk membedakan bakteri gram negative dan bakteri gram positif. Pada pengecatn ini digunakan 3 jenis bakteri yaitu Bacillus cereus, Salmonella typii dan Eshericia coli.. Pengecatan ini menggunakan 4 jenis larutan yaitu Kristal violet sebagai cat utama, larutan iodine sebagai pengintensifan cat utama, alcohol asam untuk pencucian dan safranin sebagai cat penutup. Berdasarkan percobaan diperoleh Bacillus cereus dan Salmonella typii bersifat gram positif yang berarti bakteri dapat mengikat dengan kuat cat utama cristal violet berwarna ungu, pada saat bakteri Gram positif ditambahkan dengan kristal violet maka gram positif akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya pada dinding sel, dengan pemberian larutan lugol maka kristal violet akan masuk sampai ke inti sel, pemberian alkohol menyebabkan pori-pori dinding sel mengecil sehingga warna ungu tertahan di dalam sel disebabkan oleh rendahnya kandungan lipid. Sedangkan bakteri Eschericia coli bersifat gram negative karena tidak dapat mengikat kuat cat utama dan dapat diwarnai oleh cat lawan yakni merah dari pewarna safranin.
Perbedaan gram (+) dan gram (-)
Sifat Gram (+) Gram (-)
• Komposisi Kandungan lipid rendah Kandungan lipid tinggi
• Ketahanan terhadap penisilin Lebih sensitif Lebih tahan
• Penghambatan warna Lebih dihambat Kurang dihambat
• Ketahanan terhadap fisik Lebih tahan Kurang tahan
• Kebutuhan Nutrien Kompleks Relatif










BAB V
PENUTUP
V.1 Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa :
- Pewarnaan mikroorganisme dapat dilakukan dengan cara yaitu dengan pengecatan gram, pengecatan sederhana dan pengecatan negative.
- Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin atau kristal violet, pewarnaan gram digunakan untuk membedakan antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari satu zat warna sedangkan pewarnaan negative berguna untuk mewarnai latar belakang preparat dan bakteri sendiri tidak terwarnai.
- Bakteri gram negatif pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna merah dan bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu.
V.2 Saran
Saran untuk laboratorium agar percobaan berikutnya keanekaragaman bakteri yang digunakan dapat bertambah lagi sehingga hasil yang diperoleh dapat bervariasi.






DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan.
Hadiotomo, Ratna Siri., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Pt Gramedia.

Jimmo., 2008, http ://Pembuatan PReParAT dan PengeCaTAnnyA _ BLoG KiTa.mht,. diakses pada tanggal 14 April 2009, Makassar.
Fauziah., 2008, www.fkugm2008.com/wp-content/uploads/HSC/1- 2x/6/Praktikum6.pdf. diakses pada tangan 04 April 2009, Makassar.
Filzahazny., 2008, , http:/wordpress.com/Penganta-tentang-bakteri.htm.di akses pada tanggal 08 maret 2009, Makassar.
Rizki., 2008, http ://ngecat bakterimakul-rizki.blogspot.com/2008/02/materi- kuliah.html. diakses pada tanggal 04 April 2009, Makassar.
Volk, Wesley A dan Margareth F. Wheeler., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.

Yulneriwanti., 2008, http://01-bakteri.html. diakses pada tanggal 08 Maret 2009. Makassar.